在western實(shí)驗(yàn)中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么區(qū)別？
　　選擇合適的緩沖液對于維持一定PH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性是很重要的。PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS（因?yàn)榛旌暇彌_液在一定的離子強(qiáng)度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過PBS易污染）。但我們常常要根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽離子緩沖液TBS；陽離子交換層析時，陰離子緩沖液則PBS。western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。
2. 沒有注明可以用來做western blot的一抗，可以用來做western blot嗎？
不一定,因?yàn)橛械目贵w是識別線性表位的,有的是識別構(gòu)象型表位的，識別構(gòu)象型表位的抗體不能用于western blotting，因?yàn)樵趙estern blotting中抗體識別的是*變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時被破壞。
3. 做western每次只加一種一抗，可以同時加兩種或者多種一抗的嗎？
　　還是不要同時加兩種一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。
4. western blot 使用的膜哪種啊，PVDF好還是NC膜，如何選擇？
　　PVDF膜價格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價格比較昂貴。 NC膜價格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關(guān)文獻(xiàn)。

5. 為什么出現(xiàn)了多條帶,每個加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律,為什么?是封閉時間不夠嗎？做WESTERN必須要內(nèi)參嗎？

　　一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)，抗體的特異性不強(qiáng)，目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化,而內(nèi)參的條帶基本均勻一致.這樣才有說服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴(yán)格意義上說,內(nèi)參是必須做的。
6. western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些？用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？
　　作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。做免疫印跡時選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應(yīng)條帶。
7. 半干轉(zhuǎn)是否要求膜，濾紙，膠同樣大小？因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會大一點(diǎn)，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？

　　可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， zui后結(jié)束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。
8. Western Blot哪種染色好？

（1） 陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達(dá)到1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
（2） 膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩(wěn)定。
（3） 生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。
9. 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
　　可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。

10. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？
DAB顯色在辣根過氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。
11. 酶顯色與熒光顯色之間，各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？
　　免疫酶技術(shù)就是用酶(如辣根過氧化物酶)標(biāo)記已知抗體(或抗原)，然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原(或抗體)，抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，這樣就可以識別出標(biāo)本抗原(抗體)分布的位置和性質(zhì)，通過圖像分析并可達(dá)到定量的目的。
　　免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷，但是熒光抗體染色標(biāo)本不能長期保存，對組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，免疫酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法，對石蠟切片標(biāo)本尤為適用，為免疫病理研究開辟了一條新途徑，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過適當(dāng)處理還可以進(jìn)行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù)，前者是將酶通過交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進(jìn)行的免疫反應(yīng)，稱為非標(biāo)記抗體酶技術(shù)。